1. samtools和picard的排序问题 目录
samtools和picard都有对SAM/BAM文件进行排序的功能，一般都是基于坐标排序（还提供了-n选项来设定用reads名进行排序），先是对chromosome/contig进行排序，再在chromosome/contig内部基于start site从小到大排序，对start site排序很好理解，可是对chromosome/contig排序的时候是基于什么标准呢？
基于你提供的ref.fa文件中的chromosome/contig的顺序。当你使用比对工具将fastq文件中的reads比对上参考基因组后会生成SAM文件，SAM文件包含头信息，其中有以@SQ开头的头信息记录，reference中有多少条chromosome/contig就会有多少条这样的记录，而且它们的顺序与ref.fa是一致的。
SAM/BAM文件的头信息：
@HD VN:1.3 SO:coordinate @SQ SN:chr1 LN:195471971 @SQ SN:chr2 LN:182113224 @SQ SN:chr3 LN:160039680 @SQ SN:chr4 LN:156508116 @SQ SN:chr5 LN:151834684 @SQ SN:chr6 LN:149736546 @SQ SN:chr7 LN:145441459 @SQ SN:chr8 LN:129401213 @SQ SN:chr9 LN:124595110 @SQ SN:chr10 LN:130694993 @SQ SN:chr11 LN:122082543 @SQ SN:chr12 LN:120129022 @SQ SN:chr13 LN:120421639 @SQ SN:chr14 LN:124902244 @SQ SN:chr15 LN:104043685 @SQ SN:chr16 LN:98207768 @SQ SN:chr17 LN:94987271 @SQ SN:chr18 LN:90702639 @SQ SN:chr19 LN:61431566 @SQ SN:chrX LN:171031299 @SQ SN:chrY LN:91744698 @SQ SN:chrM LN:16299 @RG ID:ERR144849 LB:ERR144849 SM:A_J PL:ILLUMINA
ref.fa中chromosome/contig的排列顺序：>chr1 >chr2 >chr3 >chr4 >chr5 >chr6 >chr7 >chr8 >chr9 >chr10 >chr11 >chr12 >chr13 >chr14 >chr15 >chr16 >chr17 >chr18 >chr19 >chrX >chrY >chrM它们的顺序一致
当使用samtools或picard对SAM/BAM文件进行排序时，这些工具就会读取头信息，按照头信息指定的顺序来排chromosome/contig。所以进行排序时需要提供包含头信息的SAM/BAM文件。
那么普通情况下我们的chromosome/contig排序情况是什么样的?
一般情况下我们获取参考基因组序列文件的来源有三个：
- NCBI
- ENSEMBEL
- UCSC Genome Browser
这里以UCSC FTP下载源为例：
这是一个压缩文件，使用
tar zxvf chromFa.tar.gz解压后，会得到多个fasta文件，每条chromosome/contig一个fasta文件：chr1.fa, chr2.fa ...之后我们会将它们用
cat *.fa >ref.fa合并成一个包含多条chromosome/contig的物种参考基因组序列文件用
grep ">" ref.fa可以查看合并后发ref.fa文件中染色体的排列顺序为：>chr10 >chr11 >chr12 >chr13 >chr14 >chr15 >chr16 >chr17 >chr18 >chr19 >chr1 >chr1_GL456210_random >chr1_GL456211_random >chr1_GL456212_random >chr1_GL456213_random >chr1_GL456221_random >chr2 >chr3 >chr4这和我们平时想象的染色体的排列顺序是不是有一些出入？难道不应该是从chr1开始到chr22，最后是chrX和chrY这样的顺序吗？
想象归想象，实际上它是按照字符顺序进行的，chr11就应该排在chr2前面
一般情况下在进行SAM文件的排序时，染色体的排序到底是按照哪种规则进行排序的，不是一个很重要的问题，也不会对后续的分析产生影响，但是在执行GATK流程时，GATK对染色体的排序是有要求的，必须按照从chr1开始到chr22，最后是chrX和chrY这样的顺序，否则会报错
面对这样变态的要求，我们怎么解决？
在构造ref.fa文件时，让它按照从chr1开始到chr22，最后是chrX和chrY这样的顺序进行组织就可以了：
for i in $(seq 1 22) X Y M;
do cat chr${i}.fa >> hg19.fasta;
done
2. SAM文件中FLAG值的理解 目录
FLAG列在SAM文件的第二列，这是一个很重要的列，包含了很多mapping过程中的有用信息，但很多初学者在学习SAM文件格式的介绍时，遇到FLAG列的说明，常常会一头雾水
what?还二进制，这也太反人类的设计了吧！
不过如果你站在开发者的角度去思考这个问题，就会豁然开朗
在mapping过程中，我们想记录一条read的mapping的信息包括：
- 这条read是read1 (forward-read) 还是read2 (reverse-read)？
- 这条read比对上了吗？与它对应的另一头read比对上了吗？
- ...
这些信息总结起来总共包括以下12项：
| 序号 | 简写 | 说明 |
|---|---|---|
| 1 | PAIRED | paired-end (or multiple-segment) sequencing technology |
| 2 | PROPER_PAIR | each segment properly aligned according to the aligner |
| 3 | UNMAP | segment unmapped |
| 4 | MUNMAP | next segment in the template unmapped |
| 5 | REVERSE | SEQ is reverse complemented |
| 6 | MREVERSE | SEQ of the next segment in the template is reversed |
| 7 | READ1 | the first segment in the template |
| 8 | READ2 | the last segment in the template |
| 9 | SECONDARY | secondary alignment |
| 10 | QCFAIL | not passing quality controls |
| 11 | DUP | PCR or optical duplicate |
| 12 | SUPPLEMENTARY | supplementary alignment |
而每一项又只有两种情况，是或否，那么我可以用一个12位的二进制数来记录所有的信息，每一位表示某一项的情况，这就是原始FLAG信息的由来，但是二进制数适合给计算机看，不适合人看，需要转换成对应的十进制数，也就有了我们在SAM文件中看到的FLAG值
但是FLAG值所包含信息的解读还是要转换为12位的二进制数
3. SAM文件中那些未比对的reads 目录
SAM格式文件的第3和第7列，可以用来判断某条reads是否比对成功到了基因组的染色体，左右两条reads是否比对到同一条染色体
有两个方法可以提取未比对成功的测序数据：
- SAM文件的第3列是*的(如果是PE数据，需要考虑第3,7列)
$ samtools view sample.bam | perl -alne '{print if $F[2] eq "*" or $F[6] eq "*" }' sample.unmapped.sam
- 或者SAM文件的flag标签包含0x4的
# 小写的f是提取，大写的F是过滤 $ samtools view -f4 sample.bam sample.unmapped.sam虽然上面两个方法得到的结果是一模一样的，但是这个perl脚本运行速度远远比不上上面的samtools自带的参数
对于PE数据，在未比对成功的测序数据可以分成3类：
- 仅reads1没有比对成功
该提取条件包括：
- 该read是read1，对应于二进制FLAG的第7位，该位取1，其十进制值为64；
- 该read未成功比对到参考基因组，对应于二进制FLAG的第3位，该位取1，其十进制值为4；
- 另一配对read成功比对到参考基因组，对应于二进制FLAG的第4位，该位取0，其十进制值为8；
# 对于取1的位点采用提取的策略，用-f参数，值设为64+4=68 # 对于取0的位点采取过滤的策略，用-F参数，值设为8 $ samtools view -u -f 68 -F 8 alignments.bam >read1_unmap.bam
- 仅reads2没有比对成功
该提取条件包括：
- 该read是read2，对应于二进制FLAG的第8位，该位取1，其十进制值为128；
- 该read未成功比对到参考基因组，对应于二进制FLAG的第3位，该位取1，其十进制值为4；
- 另一配对read成功比对到参考基因组，对应于二进制FLAG的第4位，该位取0，其十进制值为8；
# 对于取1的位点采用提取的策略，用-f参数，值设为128+4=132 # 对于取0的位点采取过滤的策略，用-F参数，值设为8 $ samtools view -u -f 132 -F 8 alignments.bam >read2_unmap.bam
- 两端reads都没有比对成功
该提取条件包括：
- 该read未成功比对到参考基因组，对应于二进制FLAG的第3位，该位取1，其十进制值为4；
- 另一配对read未成功比对到参考基因组，对应于二进制FLAG的第4位，该位取1，其十进制值为8；
# 对于取1的位点采用提取的策略，用-f参数，值设为4+8=12 $ samtools view -u -f 12 alignments.bam >pairs_unmap.bam
看完这一部分，是不是有一个感觉：FLAG玩得溜，SAM文件可以处理得出神入化
4. 为什么一条read会有多条比对记录？ 目录
首先，思考一个问题：对于PE数据，一条测序片段（fragment）有read1和read2两条测序片段，它们俩的名字相同，那么对于这一条测序片段，对它进行mapping之后得到的SAM文件中会出现几条记录呢？
先声明以下只对BWA比对得到的SAM文件进行讨论，对其他比对工具输出的SAM文件可能不适用
首先，基于经验积累告诉我，它会得到有且只有两条记录，原因在于，BWA在对每条read执行比对时只会给出一个hit，若这条read是multiple mapping的情况，它会从中选择MAPQ值最高的那个hit作为输出，若存在多个hit的MAPQ值相等且最高，那么BWA会从中随机选择一个作为输出
对于我的这个假设可以用以下的方法进行验证：
# 将SAM文件的第一列提出来，排序去重，同时统计每个QNAME出现的次数
$ samtools view alignment.bam | cut -f1 | sort | uniq -c >record.count
得到的统计结果如下：
2 ERR144849.1
2 ERR144849.10
2 ERR144849.100
2 ERR144849.1000
2 ERR144849.10000
2 ERR144849.100000
2 ERR144849.1000000
2 ERR144849.10000000
2 ERR144849.10000001
2 ERR144849.10000002
2 ERR144849.10000003
2 ERR144849.10000004
2 ERR144849.10000005
...
上面的测试结果与我们的假设吻合
但是在一次处理三代测序数据（三代测序数据是Single-End）中发现了不同：
在输出中出现了一些不太和谐的结果：有极少部分的QNAME对应2条以上的记录，这意味着存在一条read会有多条比对记录的情况，why？
对这个与预期不完全相符的结果，尝试去寻找里面的原因，其间进行了各种各样的推理、假设、验证，最终在李恒的github中找到了答案
2. Why does a read appear multiple times in the output SAM?
BWA-SW and BWA-MEM perform local alignments. If there is a translocation, a gene fusion or a long deletion, a read bridging the break point may have two hits, occupying two lines in the SAM output. With the default setting of BWA-MEM, one and only one line is primary and is soft clipped; other lines are tagged with 0x800 SAM flag (supplementary alignment) and are hard clipped.
参考资料：