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El grueso de este proyecto se desglosa en tres bloques principales, que coinciden con los objetivos marcados desde el principio. La primera parte del trabajo, se centra en reproducir la identificación taxonómica de los microorganismos presentes en las muestras. En la segunda parte, se encuentra que los datos siguen la ley de Taylor, lo que permite explorar la estabilidad temporal de la microbiota en diferentes condiciones para entender la relación con el estado de salud de los sujetos. Por último, se hace un estudio de las correlaciones entre microorganismos y se abren las puertas al uso de alternativas para medir interacciones, que es un campo donde aún queda mucho por explorar debido a su complejidad.
El primer objetivo incluye la clasificación taxonómica de diversos genomas en una misma muestra. La idea original de reproducir el proceso llevado a cabo por los autores de los datos originales, se cumple satisfactoriamente. A pesar de emplear una versión más reciente tanto del software como de la base de datos, los resultados son similares (se comprueba por comparación). Esto sirve para testar la reproducibilidad de los métodos empleados que en determinadas ocasiones es importante. Por otro lado, el nivel taxonómico alcanzado no es el más deseable. Se prefiere poder caracterizar los microorganismos a nivel de especie, o incluso de cepa, para poder dar un significado biológico a lo que ocurre en la microbiota. A nivel de género es muy difícil especificar una sola función, porque se trata de un grupo de especies que pueden englobar tanto organismos beneficiosos como patógenos. La aproximación mediante 16S es poco precisa y para un estudio más profundo es necesario el uso de la secuenciación del genoma completo (\textit{shotgun}). Esta última permite identificar las diferencias entre microorganismos aislados y conocer la información funcional y genética, llegando incluso a detectar mutaciones en el genoma. Permite mostrar el contenido de genes de la comunidad, lo que es muy útil para definir las capacidades de la comunidad comparando con bases de datos para conocer el las funciones de esos genes.
Respecto al segundo objetivo, abarca todo el análisis de series temporales y se obtienen varios resultados interesantes. Caracterizar el comportamiento global del sistema no es trivial, pero gracias a la herramienta complexCruncher se puede extraer bastante información. Esta es la parte más matemática del proyecto, pero intenta explicar la biología subyacente. Principalmente se consiguen distintos enfoques de la variabilidad del microbioma, lo que se relaciona con la salud del hospedador. Otra idea un poco diferente planteada en esta parte es identificar modos vía descomposición de Fourier. Esto sirve para encontrar posibles periodicidades en el microbioma, es decir, comprobar si se repite algún patrón a lo largo del tiempo (semanas, meses...). Los resultados no se añaden a la memoria porque no se encuentran modos elementales en esta serie temporal. Quizás porque son necesarios más puntos temporales o quizás porque simplemente no existen estos patrones.
Por último, el tercer objetivo es inferir la dinámica del sistema. Se logran medir los comportamientos paralelos entre grupos, aunque no se ha llegado a definir cada una de las interacciones que se dan entre microorganismos. Conseguir una red coloreada por bloques de especies que interaccionan entre si será el siguiente objetivo a cumplir y sería ideal que además se pudiera visualizar a través del tiempo. Como es un campo en auge, se abren así las puertas a futuros trabajos.
Como conclusiones finales al estudio, remarcar:
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\begin{itemize}
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\item ARNr 16S es una buena estrategia para la clasificación taxonómica pero no se obtienen buenos resultados más allá de género.
\item El estudio de series temporales en la microbiota permite visualizar la dinámica del sistema.
\item Los parámetros de Taylor calculados para el microbioma, están relacionados con el estado de salud del hospedador.
\item Queda mucho camino que recorrer en el campo en la biología de sistemas para desentrañar las interacciones que ocurren entre nuestros huéspedes microscópicos.
\end{itemize}
Además, la reciente publicación del artículo Martí \textit{et al.} \cite{Marti2017} recalca la envergadura de los datos utilizados y pone de manifiesto la utilidad del proyecto.
\section{Perspectivas de futuro}
El estudio de series temporales ofrece una perspectiva dinámica de cualquier sistema. En concreto, analizar el microbioma humano a lo largo del tiempo nos permite dilucidar el comportamiento de las bacterias que viven con nosotros, las cuales influyen directamente en la salud humana. En este estudio, se demuestra que en condiciones normales la microbiota tiene cierta estabilidad. Sin embargo, cuando el hospedador cambia de ambiente realizando un viaje al extranjero, su flora intestinal se desequilibra debido al nuevo entorno que ofrece el lugar de destino. Este suceso hace que aparezcan nuevos géneros y desaparezcan otros existentes. Cuando el sujeto regresa a su país de origen y a sus hábitos cotidianos, la microbiota recupera la estabilidad inicial. También se ha analizado el microbioma de la cavidad oral pero éste no sufre tanto la perturbación como el intestino.
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Una cuestión interesante que surge de este estudio es, ¿qué le pasa al microbioma de una persona emigrante? Si el sujeto hubiera permanecido más tiempo en el extranjero, habría sido muy interesante comprobar lo que sucede. Algunas posibilidades pueden ser (1) que alcance un nuevo estado de equilibrio, ya sea uno igual al estado inicial o uno nuevo (lo que sería interesante poder demostrar cuánto tiempo se necesita para adquirir el equilibrio) y (2) que nunca alcance el estado de equilibrio (lo cual sería poco probable ya que no existen casos de diarrea crónica causadas por un viaje). La hipótesis más probable es la primera porque la variabilidad disminuye de forma exponencial a partir del día 100, de lo que se deduce que ya había alcanzado el equilibrio antes de su regreso. Otra cuestión interesante es, ¿por qué no hay un nuevo desequilibrio a la vuelta del viaje? El microbioma parece que tiene memoria y no sufre tanto al reexponerse a un ambiente que ya le es conocido.
En este proyecto también se ha estudiado lo que ocurre en el caso de que un sujeto tenga una infección intestinal causada por un patógeno. De nuevo, la estabilidad de su microbioma se rompe y se puede medir el tiempo que tarda en recuperarse. Se demuestra que una infección supone el cambio del microbioma a un equilibrio nuevo. Este mismo efecto ocurre con la ingesta de antibióticos, que afecta a la mayoría de microorganismos y los oportunistas ocupan esos nichos conformando un nuevo equilibrio.
Los trabajos hasta la fecha han supuesto un enorme avance y además se ha logrado en un periodo de tiempo relativamente corto. Como ya se ha comentado, tanto las tecnologías de secuenciación como los sistemas de clasificación no son perfectos todavía e introducen errores en los resultados. Además, se ha demostrado que los intentos de explicar las relaciones entre microorganismos mediante correlaciones no muestran las verdaderas interacciones \cite{Fisher2014}. En ese mismo artículo, los autores proponen una aproximación capaz de superar todos esos obstáculos a la que han llamado LIMITS (detallada en materiales y métodos). Para comprobar su potencial y comparar los resultados expuestos en apartados anteriores, se aplicó LIMITS a los datos del estudio. En la figura \ref{LIMITS_salivaA} se puede observar un ejemplo que compara la matriz de correlaciones para los 15 géneros más abundantes en saliva A con la matriz de interacciones propuesta por LIMITS para la misma muestra. Se puede observar que hay muchas más correlaciones que interacciones y, además, no se corresponden en la mayoría de los casos. Los elementos de la diagonal obtenidos en la matriz de interacción son todos negativos. La biología subyacente a este resultado debe significar que cada una de estas especies llegaría finalmente a la capacidad de carga incluso en ausencia de otras especies. Otra diferencia importante es que la primera matriz presenta simetría, mientras que la segunda es asimétrica (lo que se ajusta mejor a la realidad debido a que un género puede interaccionar con otro pero éste no necesariamente debe interaccionar con el primero).
En resumen, LIMITS es una buena aproximación, pero hay que asumir que está ocurriendo el modelo en el que se basa y solamente ofrece dos tipos de interacción (competición o cooperación). Por tanto, ofrece una de las posibles soluciones aunque puede que no sea la correcta ni la única, ya que el mundo de las interacciones es bastante más complejo.
\begin{figure}[!h]
\centering
\subfigure{
\includegraphics[width=3in]{./Figuras/corrplot_salivaA_formatLIMITS.png}}
\subfigure{
\includegraphics[width=2.6in]{./Figuras/SalivaA_15otus_alltimes.jpg}}
\caption{Correlación Pearson vs. LIMITS en saliva A}
\label{LIMITS_salivaA}
\end{figure}
La aplicación de este tipo de estudios radica en monitorizar la administración de probióticos para prevenir y tratar enfermedades como la obesidad o la diabetes. Se requiere de forma paralela un análisis metabolómico para conocer la composición funcional de la flora intestinal y el estado inmunológico del hospedador. Con estas investigaciones, se pueden dilucidar los mecanismos moleculares del microbioma que influyen en las enfermedades y hará posible adoptar un nuevo enfoque en el desarrollo de terapias aprovechando los beneficios de la modulación de la microbiota intestinal sobre el metabolismo.
Hay una clara necesidad de una teoría que identifique patrones y principios generales del microbioma. En el campo de la ecología se han utilizado a lo largo de la historia modelos de red que están específicamente diseñados para tratar con comunidades grandes y complejas. Podría utilizarse una red multicapa que incorpore diferentes instancias de la misma especie en diferentes lugares en vez de una matriz de interacciones para una sola comunidad en el espacio \cite{Pilosof2017}. Una red multicapa consiste en: (1) ``nodos físicos'' que representan entidades (por ejemplo, géneros); (2) capas, que agrupan los nodos según alguna característica común (por ejemplo, dependencia del tiempo); (3) ``nodos de estado'', cada uno de los cuales corresponde a la manifestación de un nodo físico en una capa específica; y (4) aristas (ponderadas o no ponderadas) para conectar los nodos de estado entre sí. Es un nuevo marco que permite considerar múltiples tipos de interacciones y sus ejes permiten investigar cómo las especies se mueven entre las comunidades locales. Generar una red multicapa presenta algunas limitaciones como un esfuerzo adicional en la toma de muestras porque se requieren muchos datos de múltiples lugares, múltiples tiempos y/o diferentes métodos de observación. La ventaja es que estudiando la modularidad de las redes, se puede comprobar las variaciones temporales en el tamaño y la composición de los módulos, lo que puede ser relevante para fenómenos como estabilidad de la comunidad, coevolución y coexistencia de especies. Esta nueva perspectiva ofrece una visión teórica y empírica de la dinámica en los sistemas ecológicos.